過(guò)氧化氫酶（Catalase，CAT）試劑盒(鉬酸銨比色法)說(shuō)明書(shū)

微量法100管/96樣

測(cè)定意義：                           

CAT(EC 1.11.1.6)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，是最主要的H₂O₂清除酶，在活性氧清除系統(tǒng)中具有重要作用。

測(cè)定原理：

過(guò)氧化氫能氧化MoO₄^2-成MoO₅^2-,MoO₅^2-接受氫氧根的電子成鍵，分子間立即脫水縮合，得到穩(wěn)定的黃色復(fù)合物(H₂MoO₄·XH₂O)_n在405nm處有強(qiáng)烈吸收峰，其吸光值和過(guò)氧化氫濃度成線性關(guān)系。測(cè)定出體系剩余過(guò)氧化氫在405nm的吸光值即可反映CAT的催化活性。

需自備的儀器和用品：

酶標(biāo)儀、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96孔板、研缽、冰和蒸餾水

試劑組成和配制：

提取液：液體100 mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體10 mL×1瓶，4℃避光保存；

試劑二：液體25 mL×1瓶，常溫保存；

試劑三：液體60 mL×1瓶，4℃保存；

粗酶液提取：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴個(gè)）：提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次）；8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、   酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至405 nm。

2、在EP管中加入下列試劑

CAT活性計(jì)算：

1、標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.09x + 0.0013      R² = 1      x：體系中過(guò)氧化氫濃度變化值（μmol/mL）

                                          y：吸光值差值ΔA

2、血清（漿）CAT活力的計(jì)算:

單位的定義：每毫升血清（漿）每分鐘催化1μmol H₂O₂降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CAT(μmol /min/mL)= =(ΔA-0.0013)÷0.09×V反總÷V樣÷T

                    =444.44×(ΔA-0.0013)

3、組織、細(xì)菌或細(xì)胞中CAT活力計(jì)算：

（1）按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化1μmol H₂O₂降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CAT(μmol/min/mg prot)=(ΔA-0.0013)÷0.09×V反總÷(V樣×Cpr) ÷T

                    =444.44×(ΔA-0.0013)÷Cpr

（2）按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化1μmol H₂O₂降解定義為一個(gè)酶活力單位。

CAT(μmol/min/g 鮮重)=(ΔA-0.0013)÷0.09×V÷（W× V樣÷V樣總）÷T

                    =444.44×(ΔA-0.0013)÷W

V反總：反應(yīng)體系總體積，0.8 mL；V樣：加入樣本體積，0.01 mL；V樣總：加入提取液體積，1 mL；T：反應(yīng)時(shí)間，2 min；W：樣本質(zhì)量，g；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL。

注意事項(xiàng)：

1、   預(yù)實(shí)驗(yàn)若發(fā)現(xiàn)酶活性過(guò)高（A測(cè)定＜0.1），可用提取液適當(dāng)稀釋樣品后測(cè)定，并在計(jì)算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

2、   若A空白＜A測(cè)定，一方面可能是酶活性過(guò)低，可將反應(yīng)時(shí)間2延長(zhǎng)到5min,另一方面可能樣本中雜質(zhì)干擾嚴(yán)重，可將樣本稀釋5倍左右后測(cè)定，并在計(jì)算公式中代入實(shí)際反應(yīng)時(shí)間和乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。