鴨圓環病毒（DuCV）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）

商品名稱：鴨圓環病毒（DuCV）核酸檢測試劑盒（熒光 PCR 法）

Name：Duck Circovirus Detection Kit（Real-Time PCR Method）

【包裝規格】25T/盒、50T/盒

【預期用途】

鴨圓環病毒感染 DuCV 的鴨子所表現的臨床癥狀則主要表現為發育狀況差，并且明顯表現羽毛營養失調， 在背部脊柱（的羽毛）尤其明顯，許多羽毛羽軸出血，背部皮膚組織病理學檢查主要表現為囊泡和圍繞囊泡的組織異嗜性炎性滲出，內臟器官總的病理表現為鴨傳染性漿膜炎協同感染的癥狀，對法氏囊組織病理學檢查表明，    淋巴細胞損傷、壞死、組織細胞增多。

本試劑盒適用于檢測肝、腎、脾、肺等樣本中的鴨圓環病毒，用于鴨圓環病毒感染的輔助診斷。

【檢驗原理】

本試劑盒采用 TaqMan 探針法實時熒光 PCR 技術，設計一對鴨圓環病毒特異性引物，結合一條特異性探針， 用熒光 PCR 技術對鴨圓環病毒的 DNA 進行體外擴增檢測，用于臨床上對可疑感染病料的病原學診斷。

【試劑組成】

包裝規格25T/盒50T/盒

DuCV 反應液500μL×1 管500μL×2 管

酶液25μL×1 管50μL×1 管

DuCV 陽性質控品50μL ×1 管50μL ×1 管

陰性質控品250μL ×1 管250μL ×1 管

說明：不同批號的試劑盒組分不可交互使用

【儲存條件及有效期】

-20℃±5℃，避光保存、運輸、反復凍融次數不超過 5 次，有效期 12 個月。

【適用儀器】

ABI7500、安捷倫 MX3000P/3005P、LightCycler、Bio-Rad、Eppendorf 等系列熒光定量 PCR 檢測儀。

【標本采集】

病死或撲殺的鴨，取肺、腎等組織；待檢活豬，用注射器取血 5mL

【保存和運輸】

采集或處理好的樣品在 2℃~8℃條件下保存應不超過 24 h；若需長期保存，應放置-70℃以下保存，凍融不超過 3 次。

【使用方法】

1.樣品處理（樣本處理區）

1.1樣本前處理

組織樣品：每份組織分別從 3 個不同的位置稱取樣品約 1g，手術剪剪碎混勻后取 0.5g 于研磨器中研磨，加入 1.5mL 生理鹽水后繼續研磨，待勻漿后轉至 1.5mL 滅菌離心管中，8000rpm 離心 2min，取上清液 100μL 于 1.5mL滅菌離心管中；全血樣本：待血凝固后，取血清 100μL 于滅菌離心管中。

1.2核酸提取

推薦采用優利科（上海）生命科學有限公司生產的核酸提取或純化試劑（磁珠法或離心柱法）進行核酸提取，請   按照試劑說明書進行操作。

2.試劑配制（試劑準備區）

根據待檢測樣本總數，設所需要的 PCR 反應管管數為 N（N=樣本數+1 管陰性對照+1 管陽性對照；反應管數每滿 10 份，多配制 1 份），每測試反應體系配制如下表：

試劑DuCV 反應液酶液

用量（樣本數為 N）19μL1μL

將混合好的測試反應液分裝到 PCR 反應管中，20μL/管。

3.加樣（樣本處理區）

將步驟 1 提取的核酸、陽性質控品、陰性質控品各取 5μL，分別加入相應的反應管中，蓋好管蓋，混勻，短暫離心。

4.PCR 擴增（核酸擴增區）

4.1將待檢測反應管置于熒光定量 PCR 儀反應槽內；

4.2設置好通道、樣品信息，反應體系設置為 25μL；

熒光通道選擇：檢測通道（ReporterDye）FAM，淬滅通道（QuencherDye）NONE，ABI 系列儀器請勿選擇 ROX

參比熒光，選擇 None 即可。

4.3推薦循環參數設置：

步驟循環數溫度時間收集熒光信號

11 cycle95℃2min否

245 cycles95℃15sec否

60℃30sec是

5.結果分析判定

5.1結果分析條件設定（請參照各儀器使用說明書進行設置，以分析 ABI7500 儀器為例）

反應結束后自動保存結果，根據分析后圖像調節 Baseline 的 Start 值、End 值以及 Threshold 值（用戶可根據實際情況自行調整，Start 值可設在 3～15、End 值可設在 5～20，使閾值線位于擴增曲線指數期，陰性質控品的擴增曲線平直或低于閾值線），點擊 Analyze 自動獲得分析結果。

5.2結果判斷

陽性：檢測通道 Ct 值≤40，且曲線有明顯的指數增長曲線； 陰性：樣本檢測結果 Ct 值>40 或無 Ct 值。

5.3質控標準

陰性質控品：無特異性擴增曲線或無 Ct 值顯示；

陽性質控品：擴增曲線有明顯指數增長期，且 Ct 值≤32； 以上條件應同時滿足，否則實驗視為無效。

6.檢測方法的局限性

1.樣本檢測結果與樣本收集、處理、運送以及保存質量有關；

2.樣本提取過程中沒有控制好交叉污染，會出現假陽性結果；

3.陽性對照、擴增產物泄漏，會導致假陽性結果；

4.病原體在流行過程中基因突變、重組，會導致假陰性結果；

5.不同的提取方法存在提取效率差異，會導致假陰性結果；

6.試劑運輸，保存不當或試劑配制不準確引起的試劑檢測效能下降，出現假陰性或定量檢測不準確的結果；

7.本檢測結果僅供參考，如須確診請結合臨床癥狀以及其他檢測手段。

【注意事項】

1.所有操作嚴格按照說明書進行；

2.試劑盒內各種組分使用前應自然融化，完-全混勻并短暫離心；

3.反應液應避光保存；

4.反應中盡量避免氣泡存在，管蓋需蓋緊；

5.使用一次性吸頭、一次性手套和各區專用工作服；

6.樣本處理、試劑配制、加樣需在不同區進行，以免交叉污染；

7.實驗完畢后用 10%次氯酸或 75%酒精或紫外燈處理工作臺和移液器；

8.試劑盒里所有物品應視為污染物對待，并按照《微生物生物醫學實驗室生物安全通則》進行處理。