偽狂犬病病毒染料法熒光定量PCR試劑盒

商品名稱：偽狂犬病病毒染料法熒光定量PCR試劑盒

Name     ：Pseudorabies Virus(PrV) SYBR qPCR Kit

偽狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PrV) 會引起偽狂犬病，病豬的臨床癥狀和病程隨年齡不同而有很大差異：哺乳仔豬最為敏感，15日齡以內的仔豬常表現為最急性型，主要表現為體溫升高、拉稀、發抖、運動不協調、流涎、頸部肌肉僵硬、四肢劃水樣運動，最后昏迷死亡；育肥豬則大多數伴有體溫升高，呼吸困難，一般不發生死亡，耐過后呈長朗隱性感染帶毒或排毒；成年豬常不呈現可見臨床癥狀或僅表現為輕微體溫升高，一般不發生死亡。母豬妊娠初期，可在感染后的20天左右發生流產，在妊娠后期，經常發生死胎和木乃伊，或者產出弱胎和死胎。在完成豬瘟凈化的地區，偽狂犬病被認為是對經濟影響最大的豬病毒病，因此偽狂犬病病毒的快速準確鑒定對該病的預防和檢疫有著重要作用，為此本公司開發了簡單快捷的偽狂犬病病毒染料法熒光定量PCR檢測試劑盒，

它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供病毒樣品。

2. 根據偽狂犬病病毒保守序列設計的專一性引物，與相關病毒無交叉反應。

3. 靈敏度可以達到幾百拷貝/反應。

4. 一管式熒光定量PCR檢測，避免后續污染。

5. 本試劑盒足夠50次20μL反應體系的熒光定量PCR。

6. 本產品只適用于科研，不能用于臨床診斷。

【試劑組成】

【儲存條件及有效期】

低溫運輸、-20℃保存，有效期一年。

【自備試劑】DNA模板、10×ROX（根據機型決定，具體見使用方法）。

【使用方法】

一、稀釋PCR陽性對照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）

1.       注意：由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的DNA片段作為陽性對照。

2.      標記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。

3.      用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液（最好用帶芯槍頭，下同）。

4.      在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。

5.      換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。

6.      換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對照到5號管中，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。

7.      重復上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。

樣品DNA的制備

8.       如果有N個樣品，必須設置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）。可以用10μL上步制備的PCR陽性對照的第4號（濃度為1×10E4 拷貝/μL，10μL相當于1萬拷貝）或第5號（濃度為1×10E5 拷貝/μL，10μL相當于10萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL。

9.      用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數病毒DNA/提取試劑盒兼容。

三、設置qPCR反應（20 μL體系，在樣品制備室進行）

如果只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對

10.       照，6個用于PCR陽性對照。如果做2-3次重復，則反應設置數量相應增加2或3倍。

11.      在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：

注:僅ABI7500、7700和7900儀器需要使用ROX作為對照，其他熒光PCR儀器（如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480）不需要使用ROX，則用水替代。

12.       蓋上蓋子后上機，按下面參數進行PCR（具體PCR參數可以根據儀器不同而自行優化）。

具體操作按所用儀器推薦的流程進行。本產品中所含的熒光染料在不結合DNA時，最大吸收光譜在471 nm，結合DNA時的最大吸收光譜在500 nm，最大發射光譜在530 nm。信號采集可以設置在復性或延伸步驟。

四、數據處理

14.      如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。

       15.     如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct值應該小于或等于30。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復一次。重復實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。