天花病毒探針法熒光定量PCR試劑盒

商品名稱：天花病毒探針法熒光定量PCR試劑盒

Name     ：Variola Virus(VARV) Probe qPCR Kit

天花病毒(Variola Virus，VARV) 會引起天花，是一種烈性傳染病，感染天花病毒后的潛伏期平均約為12天，感染后的初期癥狀包括：高燒、疲累、頭疼、心跳加速及背痛。2-3天后，會有典型的天花紅疹明顯地分布在臉部、手臂和腿部。在發疹的初期，還會有淡紅色的塊狀面積伴隨疹子而出現。病灶在幾天之后開始化膿，直到第2個星期開始結痂。接下來的3-4周慢慢發展成疥癬，然后慢慢剝落。該病毒會對人體健康有較大影響，因此天花病毒的快速準確鑒定對該病的預防和檢疫有著重要作用。

因此快速檢測天花病毒具有重要意義。本產品就是以探針法熒光定量 PCR 技術為基礎開發的專門檢測天花病毒的試劑盒，它具有下列特點：

1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。

2. 引物和探針經過優化，靈敏性高。

3. 提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。

4. 特異性高，引物是根據天花病毒通用高度保守區設計。

5. 本產品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應。

6. 本產品只能用于科研。

【試劑組成】

【儲存條件及有效期】

低溫運輸、-20℃保存，有效期一年。

【自備試劑】樣品 DNA。

【使用方法】

一、稀釋PCR 陽性對照（以10E1-10E6 拷貝/μL 這6個10倍稀釋度為例）

如果做定性實驗，則此步可以跳過。如果做定量實驗，則需要稀釋陽性對照做標準曲線。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。本產品只提供 DNA 片段作為陽性對照。

1.  標記 6 個離心管，分別為 6，5，4，3，2，1。

2.         用帶芯槍頭分別加入 45μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液（最好用帶芯槍頭，下同）。

3.         在 6 號管中加入 5μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照（試劑盒提供），充分震蕩 1 分鐘， 得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

4.         換槍頭，在 5 號管中加入 5μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

5.         換槍頭，在 4 號管中加入 5μL 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照（上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E4 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。

6.         重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上用。

二、樣品 DNA 的制備

7.         如果有 N 個樣品，必須設置 N+2 個提取，多出的一個是樣品制備 PC（樣品制備陽性對照），一個是樣品制備 NC（樣品制備陰性對照）?？梢杂?span> 10μL 陽性對照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為樣品制備 PC。另外用水作為樣品制備 NC。

8.         用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數 DNA/提取試劑盒兼容。

二、Probe qPCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）

9.         如果做定量分析并且只做1次重復，則標記 N+9個PCR 管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復，則標記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），1個用于 PCR 陽性對照（用第4號管中的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為描述操作步驟，在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設 置陽性對照，并且陽性對照

10.         樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：

數據處理

12.         如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

     13.    如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 35。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。