鴿源性成分染料法熒光定量PCR試劑盒

商品名稱：鴿源性成分染料法熒光定量PCR試劑盒

本試劑盒可用于檢測食品或其他材料中是否有鴿的成分。現(xiàn)代食品加工工藝極大改變了食材原有的味道、氣味、色澤、紋理和質(zhì)地等特性，因此傳統(tǒng)的感官鑒別技術(shù)已經(jīng)無法對食材的真?zhèn)芜M(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定。同時部分食材還有致敏性，因此基于基因檢測的快速靈敏的食材來源檢測技術(shù)將對食品監(jiān)管和安全提供重要的保障。本產(chǎn)品就是為滿足這一需求根據(jù) PCR 原理開發(fā)的產(chǎn)品，它具有下列特點：

1.   即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA。

2.   根據(jù)鴿子16S rDNA基因保守區(qū)設(shè)計引物，能專一性地檢測出樣品中的鴿源成分，但不能檢測其他非鴿源的成分。

3.   熒光定量 PCR 檢測，比常規(guī) PCR靈敏10-100倍。

4.   快速，整個檢測過程（按一個樣品計）所需時間僅為 2.0 小時。

5.   一管式閉管操作，降低了交叉污染。

6.   提供陽性標(biāo)準(zhǔn)品，便于分析實驗結(jié)果。

7.   對混合樣品中鴿源成分的檢測下限為 0.001%，對樣品中鴿源成分的核酸檢測下限為 0.1ng/μL。

8.   本產(chǎn)品只能用于科研，足夠 50 次 20μL 體系的熒光定量 PCR。

【試劑組成】

【儲存條件及有效期】

低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。使用本試劑盒提供的陽性對照時，由于其濃度較高，一定要注意不要污染其他試劑和成分。最好在專門的區(qū)域操作。

【自備試劑】DNA 模板

【使用方法】

一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。

1.  標(biāo)記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2.  用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。

3.  在 7 號管中加入 5 μL 陽性對照（濃度為 1×10E8 拷貝/μL，試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4.  換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5.  換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6.  重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

7.  用自選方法純化樣品的 DNA，本產(chǎn)品跟市場上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。

8.  如果有 N 個樣品，則需要進(jìn)行 N+2 個樣品提取，多出的一個用作樣品制備陽性對照管、另一個用作樣品制備陰性對照管。如果用本試劑盒自帶的DNA釋放劑試用裝。則按下面步驟操作：

9.  配制溶液 A 工作液。以配制 1mL 工作液（足夠 10 個樣品）為例：在一干凈塑料管中加入 10

μL 溶液 A 成分一，20μL 溶液 A 成分二和 970μL 超純水，充分混合均勻即可。溶液 A 工作液可室溫放置，但最好在一周內(nèi)用完，不要長期放置。一次檢測一個樣品需要 100μL 溶液 A 工作液，1mL 工作液足夠 10 個樣品。如果待測樣品數(shù)量為其他數(shù)字，配制的溶液 A 工作液的體積需要做相應(yīng)的調(diào)整。

10.  在標(biāo)記好的 N+2 個離心管中，加入 1-5mg 固體樣品（半粒芝麻大小）或 5μL 液體樣品待測樣品。在樣品制備陽性對照中加入 5μL 陽性對照，在樣品制備陰性對照中加入 5μL 水。

11.  在每個管中加入 100 μL 溶液 A 工作液，確保固體樣品被溶液淹埋，如果是液體樣品則震蕩混勻。

12.  95℃保溫 10 分鐘。

13.  待冷卻到常溫后加入 10μL 溶液 B 并混勻得 DNA 釋放液。每個樣品得到的 DNA

釋放液足夠進(jìn)行 50-100 次 PCR。

三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

14.  如果只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于PCR 陰性對照，6 個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（也充當(dāng) PCR 陽性對照）。如果做 2-3 次重復(fù)，則反應(yīng)設(shè)置數(shù)量相應(yīng)增加 2 或 3 倍。

15.  在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：

注:僅 ABI7500、7700 和  7900 儀器需要使用ROX 作為對照，其他熒光 PCR 儀器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，則用水替代。

16.  蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進(jìn)行 qPCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù) qPCR 儀器的不同而自行優(yōu)化）。

四、qPCR 反應(yīng)參數(shù)

五、數(shù)據(jù)處理

17. 以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 DNA 濃度的log值，再推算出其濃度。

18.如果把試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于30。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間。則重復(fù)一次。重復(fù)試驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。