豬鏈球菌實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒

產(chǎn)品名稱：豬鏈球菌實(shí)時(shí)熒光PCR試劑盒

英文名稱：Streptococcus sui SYBR qPCR Kit

豬鏈球菌（Streptococcus sui）是具有莢膜的一種革蘭氏陽性球菌。可根據(jù)其細(xì)胞壁抗原成分將其大致歸類為蘭氏分群群鏈球菌。根據(jù)其莢膜抗原（CPS） 的不同，豬鏈球菌被分為 35（1~34 型,1/2 型）種血清型,其中 1，2，7，9 型是豬的致病菌。豬鏈球菌的定植部位為豬的上呼吸道，尤其是扁桃體和鼻腔。部分血清型的豬鏈球菌具有致病性，主要通過傷口感染。可引起豬的急性敗血癥腦膜炎、關(guān)節(jié)炎、心內(nèi)膜炎、肺炎等疾病。部分菌株可引起人類感染，造成細(xì)菌性腦炎或引起中毒樣休克綜合征。因此快速檢測(cè)豬鏈球菌具有重要意義。熒光定量PCR 是檢測(cè)傳染性疾病的主流技術(shù)，本產(chǎn)品就是以染料法熒光定量 PCR 技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測(cè)豬鏈球菌通用的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：

1.即開即用，用戶只需要提供 DNA 模板。

2.特異性高，引物是根據(jù)豬鏈球菌通用高度保守區(qū)設(shè)計(jì),不會(huì)擴(kuò)增其他細(xì)菌。

3.引物和擴(kuò)增體系經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性比常規(guī) PCR 高 100 倍。

4.提供無傳染性的 PCR 陽性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。

5.一管式操作，熒光 PCR 檢測(cè)，不容易產(chǎn)生環(huán)境污染。

6.本產(chǎn)品只能用于科研，本試劑盒足夠 50 次 20μL 體系的 PCR。

【試劑組成】

【自備試劑】樣品 RNA。

【注意事項(xiàng)】

一、制備標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能

污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對(duì)照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對(duì)照。

1.標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。

2.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）

3.在 7 號(hào)管中加入 5 μL 陽性對(duì)照（其濃度為 1×10E8 拷貝/μL，試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

5.換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

6.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

7.用自選方法純化樣品的 DNA，本產(chǎn)品跟市場(chǎng)上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。

8.如果有 N 個(gè)樣品，則需要進(jìn)行 N+2 個(gè)樣品提取，多出的一個(gè)用作樣品制備陽性對(duì)照管、另一個(gè)用作樣品制備陰性對(duì)照管。本試劑盒免費(fèi)贈(zèng)送1ml免DNA提取的核酸釋放劑，該釋放劑的裂解液可以直接作為PCR 模板，省略了 DNA 提取步驟。其使用手冊(cè)可向客服索取。

三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）

9.如果進(jìn)行定量分析，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照，6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。如果做定性分析，則 6 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品只選一個(gè)做（可以選 4 號(hào)，其余樣品不變）。以下只介紹定量分析的反應(yīng)設(shè)置。

10.在標(biāo)記管中按下表加入各成分：

注:僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用 ROX 作為對(duì)照，其他熒光 PCR 儀器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480） 不需要使用 ROX，則用水替代。

11.  蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。

四、熒光定量 PCR 反應(yīng)參數(shù)

五、數(shù)據(jù)處理

12.設(shè)定 60℃-96℃范圍的熔解曲線分析，排除假陽性。

13.如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品DNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

14.如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的 Ct值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。