猴痘病毒染料法熒光定量PCR試劑盒

商品名稱：猴痘病毒染料法熒光定量PCR試劑盒

Name     ：Monkey Pox Virus(MPV) SYBR qPCR Kit

猴痘病毒(Monkey Pox Virus，MPV)會引起猴痘，是一種罕見的病毒性疾病,主要發生于中部與西部非洲熱帶雨林國家。該病于1958年首ci在丹麥哥本哈根一實驗室綠猴中發現,可引起實驗用靈長類動物發病,許多非洲嚙齒動物也都有猴痘病毒感染。該病毒也可感染小鼠、大鼠和兔。1970年剛果首ci報告猴痘病毒感染人類的病例。該病毒對人和動物健康造成較大損害，因此猴痘病毒的快速準確鑒定對該病的預防和檢疫有著重要作用，為此本公司開發了簡單快捷的猴痘病毒染料法熒光定量PCR檢測試劑盒，它具有下列特點：

1.       即開即用，用戶只需要提供病毒樣品。

2.      根據猴痘病毒保守序列設計的專一性引物，與相關病毒無交叉反應。

3.      靈敏度可以達到幾百拷貝/反應。

4.      一管式熒光定量PCR檢測，避免后續污染。

5.      本試劑盒足夠50次20μL反應體系的熒光定量PCR。

6.      本產品只適用于科研，不能用于臨床診斷。

【試劑組成】

低溫運輸、-20℃保存，有效期一年

【自備試劑】

DNA模板、10×ROX（根據機型決定，具體見使用方法）。

【使用方法】

一、稀釋PCR陽性對照（以10E2-10E7拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）

注意：由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的DNA

1.       片段作為陽性對照。

2.      標記6個離心管，分別為7，6，5，4，3，2。

3.      用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液（最好用帶芯槍頭，下同）。

4.      在7號管中加入5 μL 1×10E8拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩1分鐘，得1×10E7拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。

5.      換槍頭，在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。

6.      換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL的陽性對照到5號管中，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的陽性對照。放冰上待用。

7.      重復上面的操作直到得到6個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。

二、樣品DNA的制備

8.       如果有N個樣品，必須設置N+2個提取，多出的一個是PC（樣品制備陽性對照），一個是NC（樣品制備陰性對照）。可以用10μL上步制備的PCR陽性對照的第4號（濃度為1×10E4 拷貝/μL，10μL相當于1萬拷貝）或第5號（濃度為1×10E5 拷貝/μL，10μL相當于10萬拷貝）再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為NC。如果每次制備需要200μL樣品，則PC和NC的體積也必須是200μL。

9.      用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數病毒DNA/提取試劑盒兼容。

三、設置qPCR反應（20 μL體系，在樣品制備室進行）

10.      如果只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照，6個用于PCR陽性對照。如果做2-3次重復，則反應設置數量相應增加2或3倍。

11.      在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：

注:僅ABI7500、7700和7900儀器需要使用ROX作為對照，其他熒光PCR儀器（如iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000和LightCycler480）不需要使用ROX，則用水替代。

12.       蓋上蓋子后上機，按下面參數進行PCR（具體PCR參數可以根據儀器不同而自行優化）。

13.       數據采集

具體操作按所用儀器推薦的流程進行。本產品中所含的熒光染料在不結合DNA時，最大吸收光譜在471 nm，結合DNA時的最大吸收光譜在500 nm，最大發射光譜在530 nm。信號采集可以設置在復性或延伸步驟。

四、數據處理

14.       如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值，再推算出其濃度。

      15.       如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct值應該小于或等于30。對待測樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間，則重復一次。重復實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽性。